1. Identifikasi agen Pemeriksaan mikroskopis sediaan ulas darah perifer adalah cara yang sederhana dan tepat, bilamana hewan masih dalam keadaan sakit atau baru saja mati, selama belum terjadi pembusukan. Kumannya berbentuk batang besar, Gram positif, biasanya tersusun tunggal, berpasangan atau berantai pendek. Tidak terdapat spora. Dengan pewarnaan yang baik dapat dilihat adanya selubung (kapsel).
Pemeriksaan dengan pemupukan, bahan mengandung Anthrax berupa darah atau jaringan lain yang berasal dari hewan sakit atau baru saja mati, dengan mudah dapat dipupuk pada media buatan. Jika bahan berasal dari jaringan yang telah membusuk, maka akan timbul kesulitan-kesulitan karena: Kuman Anthrax mudah mati oleh pembusukan. Kuman-kuman anthrakoid akan ikut hadir dan tumbuh.
1.1. Spesimen segar
1.1.1. Visualisasi kapsul
B. Anthracis berkapsul virulen terdapat di jaringan dan darah dan cairan tubuh lain dari hewan yang te;ah mati karena Anthrax dapat dilihat pada preparat ulas dari sepesimen tersebut yang telah dikeringkan, difixasi dan diwarnai dengan polychrome methylene blue (MçadyeanÃÔ reaction). Kapsul terwarnai pink sementara sel bacillus terwarnai biru tua. Sel-selnya terlihat berpasang-pasangan, atau rangkaian pendek. Pewarnaan Gram dan Giemsa tidak dapat mendeteksi kapsul. Kapsul tidak terdapat pada B. anthracis yang tumbuh dalam kondisi aerobic dalam nutrient agar atau nutrient broth. Alternatifnya kapsul dapat diproduksi ketika B. anthracis ditumbuhkan pada nutrient agar yang mengandung 0,70% sodium bicarbonate dan diinkubasi dalam 20% CO2.
Polychrome methylene blue dibuat dengan cara sebagai berikut: 0,30 gram methylene blue dilarutkan dengan 30 ml 95% ethanol. 100 ml KOH 0,01% dicampur dengan larutan methylene blue. Idealnya MçadyeanÃÔ stain ini harus dibiarkan kontak dengan udara dengan digoyang-goyang sesekali selama paling tidak 1 tahun untuk mengoksidasi dan mematangkan. Penambahan K2CO3 (untuk konsentrasi akhir 1%) akan mempermudah pematangan pewarnaan. Preparat ulas yang diperlukan hanya satu tetes darah atau cairan jaringan yang diulaskan secara tipis. Setelah difiksasi dan dikeringkan, satu tetes kecil (20 l) larutan p[ewarna diteteskan pada preparat ulas dan diratakan dengan loop. Setelah satu menit dicuci dengan air ke dalam larutan hypochlorite (ada 10.000 ppm chlorine). Slide diblot, dikeringkan dan diobservasi dengan oil immersion (x1000) untuk melihat adanya kapsul pink yang mengelilingi bacilli yang berwarna biru/hitam. Untuk menghindari kontaminasi laboratorium, slide dan kertas blotting harus diautoclave atau di didesinfeksi dengan hypochlorite.
1.1.2. Pembiakan dan identifikasi B. anthracis
B. anthracis tumbuh pada hampir semua tipe Nutrient Agar, akan tetapi 5 s/d 7% Sheep Blood Agar atau Horse Blood Agar merupakan medium diagnostik pilihan. Darah adalah merupakan material klinis utama untuk diuji. Sweb darah atau cairan tubuh lainnya atau sweb yang diambil dari jaringan atau organ yang terserang dapat ditumbuhkan pada blood agar. Setelah inkubasi selama 1 malam (overnight) pada suhu 37 oC, coloni B. anthracis berwarna putih atau abu-abu keputihan dengan diameter 0,3 – 0,5 mm, non haemolitik dengan permukaan basah ground-glass, dan sangat lengket ketika di ambil dengan loop. Ciri-ciri ini disebut sebagai ÅÎedusa head¡¦ Untuk mengidentifikasi B. anthracis dapat diikuti dengan uji untuk diagnosa phage gamma dan kerentanan terhadap penicillin dan induksi kapsul. Uji ada tidaknya motility merupakan uji tambahan yang dapat dilakukan.
B. anthracis tumbuh pada hampir semua tipe Nutrient Agar, akan tetapi 5 s/d 7% Sheep Blood Agar atau Horse Blood Agar merupakan medium diagnostik pilihan. Darah adalah merupakan material klinis utama untuk diuji. Sweb darah atau cairan tubuh lainnya atau sweb yang diambil dari jaringan atau organ yang terserang dapat ditumbuhkan pada blood agar. Setelah inkubasi selama 1 malam (overnight) pada suhu 37 oC, coloni B. anthracis berwarna putih atau abu-abu keputihan dengan diameter 0,3 – 0,5 mm, non haemolitik dengan permukaan basah ground-glass, dan sangat lengket ketika di ambil dengan loop. Ciri-ciri ini disebut sebagai ÅÎedusa head¡¦ Untuk mengidentifikasi B. anthracis dapat diikuti dengan uji untuk diagnosa phage gamma dan kerentanan terhadap penicillin dan induksi kapsul. Uji ada tidaknya motility merupakan uji tambahan yang dapat dilakukan.
Prosedur uji kerentanan B. anthracis terhadap bakteriophage gamma sebagai berikut; streak platte blood agar atau Nutrient agar dengan organisme tersebut dan teteskan 10 ¡¦5 ul larutan phage pada 1 tempat yang di streak. Petri dish yang mengandung 10 unit penicillin ditempatkan di arah yang berbeda. Biarkan tetesan suspensi phage masuk kedalamnya dan inkubasi pada suhu 37 oC. Biakan kontrol harus dimasukkan, untuk itu menggunakan strain vaksin . setelah diinkubasi beberapa jam jika biakan itu B. anthracis daerah dibawah phage akan terhindar dari tumbuhnya Bakteri akibat lysisnya B. anthracis, dan zona terang akan terlihat mengelilingi petri dish yang mengandung penicillin.
1.1.3. Konfirmasi virulensi dengan polymerase chain reaction (PCR)
Template DNA dapat dibuat dengan cara meresuspensi koloni B. anthracis pada nutrient agar dengan 25 l air suling dan dipanaskan pada suhu 95 C selama 10 menit; disentrifuse sebentar pada suhu 4 C; supernatannya dapat digunakan untuk PCR. Target gen yang diamplifikasi adalah protective antigen dengan PCR product 596 bp dan kapsul dengan PCR product 846 bp.
Template DNA dapat dibuat dengan cara meresuspensi koloni B. anthracis pada nutrient agar dengan 25 l air suling dan dipanaskan pada suhu 95 C selama 10 menit; disentrifuse sebentar pada suhu 4 C; supernatannya dapat digunakan untuk PCR. Target gen yang diamplifikasi adalah protective antigen dengan PCR product 596 bp dan kapsul dengan PCR product 846 bp.
1.2. Spesimen lama, bahan yang telah diproses dan bahan dari lingkungan termasuk tanah
1.2.1. Karena kemungkinan tercemar dengan mikroorganisme lain yang akan membingungkan ketika ditumbuhkan pada nonselesctive agar, disarankan menggunakan prosedur sebagai berikut:
- Sampel dihancurkan dengan 2 volume air suling, dan ditempatkan pada tangas air suhu 62,5 C selama 15 menit.
- Encerkan hingga 10, 100 atau 1000 kali. 10-100 mikroliter ditanam pada blood agar dan 2250-300 mikrolter pada PLTE agar (polymixin, lysozyme, EDTA, thgallous acetate). Semua diinkubasi pada suhu 37 C.
- Setelah diinkubasi satu malam koloninya diuji menggunakan cara yang tersebut diatas seperti pada spesimen segar.
2. Pemeriksaan biologik
Hewan percobaan yang terbaik adalah marmut. Meskipun mencit cukup baik, tetapi mencit sangat rentan terhadap kontamin lain.
o Setelah disuntik secara subkutan, marmot biasanya mati dalam waktu 36-48 jam, paling lama pada hari kelima. Jaringan marmut tersebut penuh dengan kuman Anthrax dan di bawah kulit tempat suntikan terjadi infiltrasi gelatin.
o Penyuntikan hewan percobaan adalah cara yang paling tepat untuk membedakan kuman anthraks dari kuman anthrakoid.
3. Pemeriksaan serologik
3.1. Uji Ascoli
Uji termopresipitasi Ascoli sangat berguna untuk menentukan jaringan tercemar Anthrax. Untuk uji Ascoli diperlukan serum presipitasi bertiter tinggi. Jaringan tersangka di-ekstrasi dengan air dengan cara perebusan, atau dengan penambahan kloroform. Cairan jernih yang diperoleh mengandung protein Anthrax, jika jaringan tersebut mengandung kuman Anthrax. Cairan tersebut disebut presiptinogen yang dipertemukan secara pelan-pelan dengan serum presipitasi (presipitin) dalam tabung sempit. Reaksi positif akan ditandai dengan terbentuknya cincin putih pada batas pertemuan antara kedua cairan tersebut.
3.2. Enzyme linked immunosorbent assay (ELIZA)
Sebanyak 3-5 g/ml komponen protective antigen (PA) toxin B. anthracis digunakan sebagai antigen pada pH tinggi (9,5) menggunakan carbonate-coating buffer.
Sebanyak 3-5 g/ml komponen protective antigen (PA) toxin B. anthracis digunakan sebagai antigen pada pH tinggi (9,5) menggunakan carbonate-coating buffer.
3.3. Uji hipersensitivitas (Anthraxin)
Uji ini dilakukan dengan cara menyuntikan 0,1 ml anthraxin secara intradermal pada hewan. Dilakukan pengamatan kulit 24 – 48 jam setelah penyuntikan, apakah timbul erythema atau tidak. Uji ini sebagai refleksi adanya cell-mediated immunity.
4. Diagnosa banding
Anthrax harus dibedakan dari kematian yang mendadak oleh sebab lain. Pada sapi dan babi, terutama sekali oleh pasteurellosis yang disertai gambaran pembengkakan pada leher. Pada sapi dan domba infeksi dengan Clostridia dapat menyebabkan kematian mendadak. Pada sapi perlu diperhatikan pula penyakit-penyakit leptospirosis akut, anaplasmosis, bacillary hemoglobinuria dan keracunan-keracunan oleh tanaman, timah atau fosfor yang akut. Pada kuda, anemia infectiosa yang akut, purpura hemorrhagica, macam-macam kolik, keracunan timah, dan sunstroke, mempunyai gejala-gejala serupa dengan Anthrax. Pada babi, hog cholera akut, malignant oedema bentuk pharyngeal mempunyai gejala-gejala serupa dengan Anthrax.
Pada sapi dan kerbau dapat dikacaukan dengan keracunan, radang otak, penyakit pencernaan bentuk jahat AE, SE, surra, pirosplasmosis akut, rinderpest, dan penyakit Jembrana.
Pada kuda dapat dikacaukan dengan surra, terutama jika dilihat dari timbulnya busung.
Sumber: Berita Iptek Topik: Biologi Tags: Anthraxin, B. anthracis, Diagnosa banding,Diagnosa laboratorium, ELIZA, Enzyme linked immunosorbent assay, Identifikasi agen, PCR,Pemeriksaan biologik, Pemeriksaan serologik, penyakit Anthrax, Polychrome methylene blue, polymerase chain reaction, Spesimen segar, Template DNA, termopresipitasi, Uji Ascoli, Uji hipersensitivitas, Visualisasi kapsul
0 komentar:
Posting Komentar